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简化组培简介

发布日期：2005-1-29 15:58:32)  浏览人数：4236

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植物组织培养技术始于20世纪初，是以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术。早在1902年，德国著名的植物学家Haberlandt就根据细胞理论预言了细胞的全能性。90多年来，经许多研究者的辛勤探索，该技术日趋完善，并在科学研究与现代化农业生产中充分显示出其优越性。它具有可以快速繁殖优良品种、改良品质、节省劳力、充分利用空间、全年试验生产、不受自然条件限制等特点。所培养的组培苗体积小，便于携带和资源交流。该项技术在推动农业现代化方面已经取得巨大的经济、社会和生态效益，被认为是一项很有潜力的高新技术。     目前世界上，植物组织培养技术在不少国家和地区已由实验室研究阶段一跃而成为大规模成批量的工厂化生产方法。“优良无性繁殖系的快速繁殖和试管品种的商品化，是目前植物组织培养和细胞培养在应用上的主流之一”，六、七十年代以来，国外组培苗发展很快，欧洲许多国家纷纷建立起植物微繁公司。据欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）1991年公报，西欧国家共有248个植物微繁公司，重点是繁殖那些经济价值较高的观赏植物，如洋兰、香石竹、月季、安祖花、唐菖蒲、玉簪、蕨类、大花萱草等30余种。自80年代以来，以商品生产为目的的组培苗年产量以20%～30%的速度递增。这些公司年产组培苗在10万株以上的约占50%，大于50万株的约占25%，整个西欧年产试管苗达20多亿株。亚洲许多国家组培苗商品化也极为普遍。我国植物组培水平较高，许多单位结合脱毒和微体嫁接进行的微体快繁也初具规模，现已作为一种试验系统广泛应用于科研和生产中。但是，组培苗商品化起步较晚，该产业与国外相比还有一定差距，仍需加大在这方面的研究工作。据预测，市场在未来的10年内对组培苗的需求量将以7～8%的速度递增，这为植物组织培养快繁技术提供了广阔的前景。     从目前植物组织快繁技术的现状来看，大部分单位或公司采用的是外植体诱导芽分化、继代培养、生根、炼苗、移栽等组培程序。组培材料以培养基内糖类作为能源，在恒温、恒光强、封闭无菌的环境中，建立了适生的实验室异养生态系统, 当苗木形成后再转移到自养生态系统时，也既实验室手段快繁和大田移栽相结合使两种系统的转化有时过快，必然会暴露出商业化生产方式中一些急需解决的问题。第一，无菌外植体获得较难，材料带菌或褐变，均会影响外植体的分化，增加投入；第二，组培苗是在全封闭的无菌环境中培养，操作程序繁杂，培养时间较长，而且每个环节都有可能增加杂菌的污染机会，耗费大量的人力、物力、财力；第三，配置培养基所用药品种类繁多且价格较高，培养过程对设备要求精细；第四，全部过程耗费大量电力，特别是漫长的灯光培养更是提高了成本；第五，目前的生根方法和移栽成活率不理想，生根后把试管苗从优越的无菌环境条件下，经过炼苗后，移栽在光照强、变温、多菌的室外环境条件中，其适应能力差，移栽成活率低。诸如此类问题，导致试管苗要比普通苗价格高几倍或几十倍，严重限制了该技术在广大基层单位的普遍推广，致使许多植物品种仍保存在试管内，得不到开发利用。要使组培快繁从实验室走向产业化，形成一种商品化的技术手段，让更多的植物组培品种走向市场，必须对现有组培快繁体系进行改革，简化程序，降低成本，缩短周期。     针对上述问题，许多科研单位和公司积极投资加强这一方面的研究。近几年来，虽然取得了一些进展，可是，就目前的研究报道而言，均局限于极少数植物组培快繁过程中某一环节的改进，不具有普遍性，仍存在一些缺点，并且对于简化组培快繁体系的系统性研究，国内外均未见报道。针对组培快繁体系中所面临的难题，简化程序、降低成本、方便操作、提高移栽成活率从而最终降低组培苗的价格，建立起一套实用的组培快繁体系，以便普及推广，给现代化农业生产注入新的活力，是一项势在必行的工作。     我们生物技术研究室，针对当前植物组培快繁过程中所出现的问题，于1997~2000年以林木（花椒、杨树）、果树（樱桃colt砧木、珠美海棠、草莓、平邑甜茶、冬枣、茶树）、花卉（大岩桐、一品红、月季）、和农作物甘薯等几十种植物为试材，对组培快繁技术体系进行了简化程序、降低成本、提高移栽成活率及相关生理活性等方面的研究。主要成果如下： 1.获得了快速建立无菌外植体的方法。通过磁力震荡、外部喷药和及时抢救处理，延长灭菌时间，实施彻底灭菌，同时可减轻对外植体的伤害，降低死亡率和褐变率，获得无菌体的成功率高达86.5%，比常规灭菌提高30%。2.筛选净化自来水和卡拉胶等廉价的替代品用于组培生产，其培养物能正常分化生长，培养基的成本降低为常规的12.2%；3。利用自然光替代人工辅助光照，设计类型多样的自然光照培养室，研究结果证明在变温（15~30℃）、变光强（1000~3000lux）的条件下，组培苗在变化的环境中得到锻炼，形成壮苗，节约了电能，培养成本降为常规的73.5%。4.采用培养小筒和滤纸桥生根法。组培苗生根率高、长根快、根系健壮、程序简化、操作方便、运输安全、可直接移植在配有一定有机质和腐叶土的壤土中,移栽成活率高达90%以上，成本降低为常规的13.26%。5.瓶外生根苗的生理活性高。通过瓶外与瓶内培养所获得的生根苗经生理活性测定相比较，瓶外生根苗生理活性高于瓶内生根25.6%，证实了瓶外培养生根后移栽成活率高于培养瓶内生根的内在原因。6建立起植物组培快繁技术新体系。高效建立无菌外植体，利用廉价替代品和自然光进行快繁；创造新型生根途径等措施。经成本核算，应用该体系所获组培苗的价格只为常规的29.12%，大幅度降低了组培苗成本。建立起全方位、多方法、整套技术程序简化的植物组培快繁产业化技术新体系。多项创新填补了国内外该领域的空白。经省内外专家鉴定，该项研究达到国际先进水平。2002年获山东省科学技术进步二等奖。该研究成果已向全国进行推广应用。

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无菌外植体的建立
(发布日期：2005-1-29 16:00:32)  浏览人数：2876



   外植体的选择与灭菌是植物组培快繁中的重要环节，它由原培养材料、灭菌剂、灭菌方法等因素决定，寻找快速、高效的灭菌方法，减少污染瓶的丢弃，对于降低成本具有重要的意义。

    1、方法对成功率的影响

    大量的试验证明，0.1%的升汞是最理想的杀菌剂，但灭菌时间要求极为严格。时间过短，杀菌不彻底，时间过长，会对组织细胞有杀伤作用，不利于外植体诱导分化。在杀菌方式的比较试验中看出，不同的清洗方式对外植体的杀伤率和成活率影响极大，通过磁棒搅动冲洗能够加大对升汞残留的冲洗，减少对材料的杀伤作用，降低褐化率，提高成功率。

    2、外植体的幼嫩程度、灭菌条件对其成活率的影响

    外植体的幼嫩程度不同，其含菌量也不同，所需的灭菌条件也有差异。从酒精浓度、0.1%升汞灭菌时间两个方面进行试验，结果表明：幼嫩的外植体材料（如幼叶、幼芽、幼茎段）幼嫩的材料比老材料带菌量少，不仅所需0.1%的升汞的灭菌时间短，在7-9分钟之间能达到灭菌效果，而且酒精可用50%来代替70%，酒精浓度的降低，可以减少对材料的伤害，不降低其粘着效能，有利于升汞的杀菌作用，提高外植体的成活率。老的材料（如半木质化、木质化的茎段）茎段内生菌较多，皮部粗糙，所需0.1%升汞灭菌的时间就长（在9-12分钟之间），且必需用70%的酒精，才能起到较好的灭菌效果。根据不同接种材料，采用不同的措施，就会减少不必要的失败和投资经费，提高成功率。

    3、不同品种外植体及取材季节对成活率的影响

    在接种外植体时，有的材料易发生褐变现象，它的产生可分为两种形式：一种是由于细胞受胁迫条件等不利条件影响所造成的死亡或自然发生的细胞死亡而引起的；另一种是材料伤口处分泌出的酚类化合物引起的，前者可以通过采取适当的措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生褐变，而后者很难清除，严重影响外植体的诱导分化。只有选择合理的外植体，才能降低褐变现象，大部分易褐变的材料，从11月份到第二年2月份褐变率很低，随着进入生长季节，褐变率逐渐上升，在5、6、7、8月份达到最高峰，然后自9月份后褐变率逐渐下降直到不再发生，为此对易褐变的外植体应在11月到2月取材，通过培养箱内水培催芽取幼嫩部分，或待接种材料放入温室内，保持半木质化，可获得理想的原始培养材料。

    外植体所带菌的种类、数量与材料种类和取材季节有关，同时，材料成活率的高低与材料取材的时间及材料本身特性也有关。试验表明，上年11月份到下年4月份取材最好，4月份到6月份与9月份到11月份取材较好，6月份到9月份较差。试验中污染若以细菌为主则成功率高,如平邑甜茶、月季、樱桃、杨树等；以真菌为主则成功率低，如冬枣、花椒、茶树等；一品红由于本身分泌白色乳状物，灭菌较困难成功率亦较低。因此选择适宜的基因型材料，适时接种，可大大提高成功率，减少投资损失。

超净工作台，价格昂贵，耗电大，极大增加了组培的前期投入和生产成本。而采用简化接种箱，只要严格操作，做好环境灭菌，同样能达到组培接种的需要，极大降低组培的成本，接种箱消毒八字诀： 很多苗种生产大户在接种箱消毒过程中不按操作规程操作，消毒不彻底或人为带菌，而导致制种失败，造成极大浪费和经济损失，严重的延误时节，影响产量产值。可以这样说：接种箱消毒是否彻底，直接关系到菌种的优劣和成品率。笔者通过长期的实践与观察，把其

    即“入、擦、烧、喷、薰、照、轻、除。”

    1.入：将预备接种的培养基、菌种、接种用具及消毒用品全部放八接种箱，封闭接种箱 2.擦：接种前用75%的酒精棉球擦手，然后伸进接种箱复擦一次，特别是手指夹内，并擦拭所有用具。

    3.烧：用酒精灯火焰外焰烧灼接种器具，待其冷却待用。

    4.喷：双手伸进接种箱，用已装好3%来苏水或5%石碳酸的小喷雾器喷雾，沉降粉尘，净化接种箱。

    5.薰：将称量好的高锰酸钾倒入甲醛溶液中产生蒸汽薰蒸，消毒30分钟，杀死箱内杂菌，其比例为高锰酸钾5g/m3，加10ml甲醛溶液。

    6.照：用紫外线灯照射15-30分钟7.轻：接种时轻拿轻放

    8.除：指将无关物品全部清除出接种箱。

    除此之外，也可自制超净工作台，同样节省成本，效果也不错

    同时也适用于组培爱好者进行家庭组培。

简化组培物品替代之二
(发布日期：2005-1-29 20:13:16)  浏览人数：2593



  高压灭菌锅是一个可以密闭并能耐一定压力的金属锅，是湿热灭菌方法的一种。由于湿度高，蒸气穿透力强，在较短时间内可达到彻底灭菌的效果。但高压灭菌锅，容量越大，价格越高，往往需要花费上万元，且灭菌过程长耗电多，一个手提式灭菌锅也在千元左右，因此对于小规模生产或家庭组培就不太使用，我们可以用家用高压锅代替，24cm家用高压锅，灭菌20分钟，共40分钟一锅。对于规模稍大的，要想节省投入可以自制高压灭菌锅，用煤加热。现介绍一种灭菌锅的简易制作方法，用农户家庭做饭用的铁锅代替，铁锅沿上围上圆形木桶或铁皮桶，这种方法适于在室外，经济实用，同样可以达到目的。

简化组培物品替代之四
(发布日期：2005-1-29 20:17:49)  浏览人数：2374



  万分之一天平价格昂贵，大部分型号都在万元以上，起作用主要是准确称量微量元素和激素。考虑到成本投入，用百分之一天平就能完成所有的称量。例如：要称量0.0025g硫酸铜，我们可以用百分之一天平称取0.25g,先配成母液,然后分别量取使用。通过试验表明，不管是激素还是微量元素，用此种方法称量十分准确，组培苗不受任何影响。

简化组培物品替代之五
(发布日期：2005-1-29 20:19:21)  浏览人数：2562



  培养基是根据植物生长发育需要的营养而设置的，它既有植物所需的氮、磷、钾、锌、铁等矿质元素，同时还含有对植物生长发育起促进和调节作用的有机物质及植物激素。进行植物组培时，适宜的培养基对培养成功有很大关系。所以在选择替代品时，必须对组培材料无毒害，而且能正常分化生长 （诸葛强，1990，史跃林，1990，Yang.Z，1993）；（1）在培养基的成本中，琼脂的价格最高，寻找适宜的廉价替代品，可以大大降低其费用。卡拉胶非常便宜，用卡拉胶替代琼脂，组培苗生长速度加快，茎叶根生长量大，叶片表现为绿色，尤其快繁珠美海棠、兰花、草莓、大姜和杨树时，组培苗生长粗壮、叶片浓绿。卡拉胶在40天之后易融化，形成浓稠液体状，更易使培养物吸收营养物质，有助于克服延迟转瓶培养基硬化的状。玉米淀粉也可以作为琼脂的替代品，应用它配置的培养基具有促进植物组织生长分化，同时对生根诱导有一定的作用，但是存在着热糊粘度大，流动性差，瓶壁残留过多，强度低，脆弱和不稳定等缺点，目前应用的较少（焦顺三，1994；Henderson W.E etc，1988；Kinnersjey A.M etc，1988）。（2）用白开水替代蒸馏水，须将自来水煮沸，冷却后使杂质沉淀，取上清夜用于配制培养基，现已普遍应用（黄贞光，1990，冯敏，1992，朱大宝，1990，1997）。本实验在自来水中加入几滴净水剂，沉淀絮状沉淀物，取上清夜用于配制培养基，对组培苗分化生长没有出现任何危害，其结果优于白开水，和应用纯净水结果相同，而且节约了电能和其他费用。（3）激素的替代品较少，只报道过用农用型6—BA替代分析纯6—BA，对分化生长有一定的作用。但应用不多，在这方面研究的较少。因此研制新型、低廉、能普遍应用的激素，具有重要的意义。

滤纸桥瓶外生根技术
(发布日期：2005-1-29 20:24:16)  浏览人数：2684



  组培苗生根移栽，一般情况要经过在培养基内添加生根激素，20-40天后，将生根瓶苗通过室外练苗，洗净琼脂，再移植在基质土中，其过程较麻烦，成活率有的不高。所采用的滤纸桥瓶外生根，基本能解决上述问题。

    1、实验条件：在温室内搭建塑料拱棚，长2m，宽1m，在薄膜上面加上微喷设施，以便调节温度，在拱棚的一侧设有加湿器的通道，允许湿雾进入棚内，并根据光强在拱棚上搭遮阴网。

    2、操作过程：在组培室中剪取1.5-2.0cm长的带顶芽的茎段，余下部分可作继代扩繁培养。所剪取茎段的基部在一定浓度的生长素蘸过后，轻轻插入滤纸桥中，放入棚内有一定营养液的的长方形容器内，然后启动调控措施。在操作过程当中，要对茎段不时的喷水雾以防止失水过多而萎蔫，通过观察茎段的生根情况，并根据所出现的情况及时调整光强，温度、湿度，筛选出最佳的生根条件。

    3、影响滤纸桥瓶外生根的因素

    组培苗在瓶外生根时，内外环境条件相差很大，因此影响因素很多，包括基质、激素、营养成分、组培苗的质量、光照、温度、湿度及其它微生物的干扰等（1）对环境条件的要求：实验证明如果有一方面出现问题，那么可能导致实验失败，所以每一环节都必须筛选出最佳的范围。大量实验证明，光照在4000~10000lux，湿度在80~95%，温度在15~30℃内变化，使组培苗在变化环境中生根的同时，得到了锻炼，逐步增强对外界环境的适应能力，因此在进行瓶外生根时，控制好适宜的外界环境条件是首要的。减少对组培苗损害。据资料记载，植物对激素的要求大多以IBA为主，诱导生根时间短，生根率高，生根数量多。个别也有差异，这是由组培苗体内的激素所决定；在选取基质时，所报道实验中大部分以沙、泥炭土、锯末、蛭石等。这样所生根向四伸展，在取苗、移栽时易损伤根，导致移栽失败，而用滤纸桥培养生根时，所生根在同一个平面上面，运输时，可叠在一起，不易伤根，易移栽，操作方便。当然影响生根率的因素还有其他方面，如向基质加一定的营养物质可有助于生根、壮苗。剪取的组培苗以中壮苗最好，中壮苗适应环境能力较弱苗强，且在剪取中壮苗后，余下的弱苗可进行继代培养，这样既可以提高生根率、壮苗率，又可以延续繁殖，经济节约，在不同季节生根有一定差异，这主要由于外界环境引起；春秋季温度、光强适宜，故是进行生根的最佳季节，而夏季温度、湿度高、杂菌多，生根、移栽易造成烂苗，通过淋水、加盖遮阴网也达不到理想的范围内，生根移栽较春秋差。在冬季昼夜温差大、湿度低，特别在夜间温度较低，生根慢，生根情况较差，生根苗移栽缓苗慢，不宜瓶外生根，从另一方面说冬季杂菌少，对组培苗干扰轻，适宜大规模的快繁。

自然光培养
(发布日期：2005-1-29 20:52:56)  浏览人数：2567



  在材料的培养过程中，无论是诱导分化还是继代培养，材料在初始培养阶段主要是利用培养基中的营养物质来分化生长，只进行少量的光合作用，但是，随着组培苗的长高对光照的需求也增加。常规培养要求日光灯辅助光强12—14小时，光强为800—3000lux（谭文澄，1991），这样就需耗费大量的电能（ 9.0元/1根灯管.月），这是一个造成成本过高的主要原因之一，而且在恒定的温度、光强、无菌的条件下所培养组培苗对外界环境的适应力差。如果充分利用自然条件来设计培养室，将常规的恒温辅助光强改为变动温度及自然光照培养，温度可通过空调来调温，外加辅助如冬季加暖气，夏季淋水亦可调温，使温度保持在18—28℃左右，光强可通过花玻璃，加遮阴网来调节，使光强在1000-3000lx内变化。

    1、自然光照培养室的建设

    为了充分采光进行有效组织培养，对于新建组培室，济南农业开发区采用了东南西三面采光方便的望远镜式双园形设计，内径6M，长31M、高度7M。外层建成双层花玻璃封闭式结构，即能保证有充足的进光量，又能避免直射阳光的不均匀照射。内置培养架外圈排二列计18个，内层为一排计7个，基本达到每个培养架尽量争取光源的原则。屋内上顶按装日光灯以补充照明，所有物体均涂以白色材料，反光照明。其建筑见图。其培养效果很好，由此培养的植物体分化正常，生长健壮。

    后三个组培室的瓶苗培养室均采用平房式圆形建筑结构，以便在培养过程中，全天都可以采用自然光照，并且房子屋顶开大天窗，解决屋的内部和北部光太弱的问题。2、简易组培室的建设

    山农大以面积30m2一面坡的温室为依托内建10 m2的小型双层透明塑料培养室，排放6个架子，光照强度晴天5000LX，阴天为800-1000LX。

    3、已有组培室的改造

    该苗圃原有仓库二间，其中一间改为组织培养植物组培室，面积30m2，东南西三个方向均不靠任何建筑物，窗户为1.6×1.8m，经测量后，将三面墙体改为低高0.5m，长宽各为2.0×2.5m的双层全玻璃窗。培养架沿窗摆放双排，屋中呈方形摆放6个架子。

    4、无灯培养架

    借助自然光培养，培养架可不设灯管，极大的降低了用电费用。

山农一号是一种广谱生物杀灭剂，能够杀死各种细菌和真菌细胞，阻止孢子萌发。其活性成分能够穿透菌类细胞壁，抑制部分参与主要新陈代谢循环的酶类活性，抑制柠檬酸循环和电子传递等，同时也能够阻断一些单糖和氨基酸从培养基到菌类细胞的运转。
    山农一号针对抑制多种菌类代谢酶活性而设计，在组培过程中，不会引起菌类的抗药性，可多代使用。山农一号有四种剂型,性质稳定，耐高压灭菌，能与抗生素类配合使用。
    利用山农一号进行开放式组织培养,不经高压灭菌和超净工作台接种，利用自然光温室壮苗生根培养，最大程度简化了组培环节、降低了组培成本。
经过进一步的改造，最终研制出了四种有效剂型：
    Ⅰ 外植体剂型（杀菌能力强，渗透性强）
    Ⅱ 分化生根剂型（药效期长）
    Ⅲ 共生菌专用剂型（更偏重于抑菌效果，对内生菌多的植物如兰花、桉树等）
    Ⅳ 瓶内催花剂型（杀菌和抑菌效果均好，利于成花，用于早期鉴定克隆性状和观赏)

不同培养基(culture medium)及其特点 (发布日期：2005-1-29 18:50:19) 浏览人数：4142 (1)MS培养基 其无机盐和离子浓度较高，为较稳定的离子平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物细胞的营养和生理需要。它的硝酸盐（钾、铵）的含量较其他培养基为高，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体的培养，效果良好。 （2）B5培养基 其含有较低的铵，该成分可能对不少培养物的生长有抑制作用。但由实践可知，有些植物在该培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 （3）White培养基 其无机盐数量较低，适于生根培养。